BDDE క్రాస్-లింక్డ్ ఆటోక్లేవ్‌లో కొత్త ప్రతిచర్య ఉప-ఉత్పత్తుల గుర్తింపు

ప్రస్తుతం మీ బ్రౌజర్‌లో జావాస్క్రిప్ట్ నిలిపివేయబడింది.జావాస్క్రిప్ట్ నిలిపివేయబడినప్పుడు, ఈ వెబ్‌సైట్ యొక్క కొన్ని విధులు పని చేయవు.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philipp Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, Spain * ఈ రచయితలు ఈ పనిలో కొంత భాగాన్ని కలిగి ఉన్నారు. సహకారం నేపథ్యం: హైలురోనిక్ యాసిడ్ (HA) అనేది సహజంగా లభించే పాలిసాకరైడ్, ఇది సౌందర్య ప్రయోజనాల కోసం డెర్మల్ ఫిల్లర్ల ఉత్పత్తిలో ఉపయోగించబడుతుంది.ఇది మానవ కణజాలాలలో చాలా రోజుల సగం జీవితాన్ని కలిగి ఉన్నందున, HA- ఆధారిత చర్మపు పూరకాలను శరీరంలో వారి జీవితాన్ని పొడిగించేందుకు రసాయనికంగా సవరించబడతాయి.HA గొలుసులను క్రాస్‌లింక్ చేయడానికి క్రాస్‌లింకింగ్ ఏజెంట్‌గా 1,4-బ్యూటానియోల్ డిగ్లైసిడైల్ ఈథర్ (BDDE)ని ఉపయోగించడం వాణిజ్య HA-ఆధారిత పూరకాలలో అత్యంత సాధారణ మార్పు.అవశేష లేదా స్పందించని BDDE <2 పార్ట్స్ పర్ మిలియన్ (ppm) వద్ద నాన్-టాక్సిక్‌గా పరిగణించబడుతుంది;అందువల్ల, రోగి భద్రతను నిర్ధారించడానికి తుది చర్మపు పూరకంలో అవశేష BDDE తప్పనిసరిగా లెక్కించబడాలి.పదార్థాలు మరియు పద్ధతులు: లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (LC-MS) కలపడం ద్వారా ఆల్కలీన్ పరిస్థితులలో BDDE మరియు HA మధ్య క్రాస్-లింకింగ్ రియాక్షన్ యొక్క ఉప-ఉత్పత్తిని గుర్తించడం మరియు వర్గీకరించడాన్ని ఈ అధ్యయనం వివరిస్తుంది.ఫలితాలు: వివిధ విశ్లేషణల తర్వాత, HA-BDDE హైడ్రోజెల్‌ను క్రిమిసంహారక చేయడానికి ఉపయోగించే ఆల్కలీన్ పరిస్థితులు మరియు అధిక ఉష్ణోగ్రత ఈ కొత్త ఉప-ఉత్పత్తి, "ప్రొపైలిన్ గ్లైకాల్-వంటి" సమ్మేళనం ఏర్పడటానికి ప్రోత్సహించినట్లు కనుగొనబడింది.LC-MS విశ్లేషణ BDDE వలె అదే మోనోఐసోటోపిక్ ద్రవ్యరాశిని కలిగి ఉందని, విభిన్న నిలుపుదల సమయం (tR) మరియు విభిన్న UV శోషణ (λ=200 nm) మోడ్‌ను కలిగి ఉందని LC-MS విశ్లేషణ నిర్ధారించింది.BDDE వలె కాకుండా, అదే కొలత పరిస్థితులలో, ఈ ఉప-ఉత్పత్తి 200 nm వద్ద అధిక గుర్తింపు రేటును కలిగి ఉందని LC-MS విశ్లేషణలో గమనించబడింది.ముగింపు: ఈ ఫలితాలు ఈ కొత్త సమ్మేళనం నిర్మాణంలో ఎపాక్సైడ్ లేదని సూచిస్తున్నాయి.వాణిజ్య ప్రయోజనాల కోసం HA-BDDE హైడ్రోజెల్ (HA డెర్మల్ ఫిల్లర్) ఉత్పత్తిలో కనుగొనబడిన ఈ కొత్త ఉప-ఉత్పత్తి ప్రమాదాన్ని అంచనా వేయడానికి చర్చ తెరవబడింది.కీలకపదాలు: హైలురోనిక్ యాసిడ్, HA డెర్మల్ ఫిల్లర్, క్రాస్-లింక్డ్ హైలురోనిక్ యాసిడ్, BDDE, LC-MS విశ్లేషణ, BDDE ఉప-ఉత్పత్తి.
హైలురోనిక్ యాసిడ్ (HA)పై ఆధారపడిన పూరకాలు సౌందర్య ప్రయోజనాల కోసం ఉపయోగించే అత్యంత సాధారణ మరియు ప్రసిద్ధ చర్మపు పూరకాలు.1 ఈ డెర్మల్ ఫిల్లర్ ఒక హైడ్రోజెల్, సాధారణంగా >95% నీరు మరియు 0.5-3% HA కలిగి ఉంటుంది, ఇది వాటికి జెల్ లాంటి నిర్మాణాన్ని ఇస్తుంది.2 HA అనేది పాలిసాకరైడ్ మరియు సకశేరుకాల యొక్క ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ మాతృక యొక్క ప్రధాన భాగం.పదార్థాలలో ఒకటి.ఇది (1,4)-గ్లూకురోనిక్ యాసిడ్-β (1,3)-N-ఎసిటైల్‌గ్లూకోసమైన్ (GlcNAc) గ్లైకోసిడిక్ బంధాల ద్వారా అనుసంధానించబడిన పునరావృత డైసాకరైడ్ యూనిట్‌లను కలిగి ఉంటుంది.ఈ డైసాకరైడ్ నమూనా అన్ని జీవులలో ఒకే విధంగా ఉంటుంది.కొన్ని ప్రోటీన్-ఆధారిత పూరకాలతో పోలిస్తే (కొల్లాజెన్ వంటివి), ఈ లక్షణం HAను అత్యంత జీవ అనుకూల అణువుగా చేస్తుంది.ఈ ఫిల్లర్లు రోగి యొక్క రోగనిరోధక వ్యవస్థ ద్వారా గుర్తించబడే అమైనో యాసిడ్ సీక్వెన్స్ విశిష్టతను ప్రదర్శించగలవు.
డెర్మల్ ఫిల్లర్‌గా ఉపయోగించినప్పుడు, HA యొక్క ప్రధాన పరిమితి హైలురోనిడేస్ అని పిలువబడే ఎంజైమ్‌ల యొక్క నిర్దిష్ట కుటుంబం కారణంగా కణజాలాలలో వేగంగా టర్నోవర్ చేయడం.ఇప్పటివరకు, HA నిర్మాణంలో అనేక రసాయన మార్పులు కణజాలాలలో HA యొక్క సగం జీవితాన్ని పెంచడానికి వివరించబడ్డాయి.3 ఈ మార్పులలో చాలా వరకు HA చైన్‌లను క్రాస్-లింక్ చేయడం ద్వారా పాలిసాకరైడ్ పాలిమర్‌లకు హైలురోనిడేస్ యాక్సెస్‌ను తగ్గించడానికి ప్రయత్నిస్తాయి.అందువల్ల, వంతెనలు ఏర్పడటం మరియు HA నిర్మాణం మరియు క్రాస్-లింకింగ్ ఏజెంట్ మధ్య ఇంటర్‌మోలిక్యులర్ సమయోజనీయ బంధాల కారణంగా, క్రాస్-లింక్డ్ HA హైడ్రోజెల్ సహజ HA కంటే ఎక్కువ యాంటీ-ఎంజైమ్ డిగ్రేడేషన్ ఉత్పత్తులను ఉత్పత్తి చేస్తుంది.4-6
ఇప్పటివరకు, క్రాస్‌లింక్డ్ HAను ఉత్పత్తి చేయడానికి ఉపయోగించే రసాయన క్రాస్‌లింకింగ్ ఏజెంట్లలో మెథాక్రిలమైడ్, 7 హైడ్రాజైడ్, 8 కార్బోడైమైడ్, 9 డివినైల్ సల్ఫోన్, 1,4-బ్యూటానియోల్ డైగ్లైసిడైల్ ఈథర్ (BDDE) మరియు పాలీ(ఇథిలీన్ గ్లైకాల్) డైగ్లిసిడైల్ ఈథర్ ఉన్నాయి.10 ,11 BDDE ప్రస్తుతం అత్యంత సాధారణంగా ఉపయోగించే క్రాస్‌లింకింగ్ ఏజెంట్.ఈ రకమైన హైడ్రోజెల్‌లు దశాబ్దాలుగా సురక్షితమైనవని నిరూపించబడినప్పటికీ, క్రాస్‌లింకింగ్ ఏజెంట్‌లు సైటోటాక్సిక్ మరియు కొన్ని సందర్భాల్లో ఉత్పరివర్తన చెందే రియాక్టివ్ రియాజెంట్‌లు.12 కాబట్టి, చివరి హైడ్రోజెల్‌లో వాటి అవశేష కంటెంట్ తప్పనిసరిగా ఎక్కువగా ఉండాలి.మిగిలిన ఏకాగ్రత మిలియన్‌కు 2 భాగాలు (ppm) కంటే తక్కువగా ఉన్నప్పుడు BDDE సురక్షితంగా పరిగణించబడుతుంది.4
గ్యాస్ క్రోమాటోగ్రఫీ, మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (MS), న్యూక్లియర్ మాగ్నెటిక్ రెసొనెన్స్ (NMR) ఫ్లోరోసెన్స్ మెజర్‌మెంట్ మెథడ్స్‌తో కూడిన గ్యాస్ క్రోమాటోగ్రఫీ, సైజ్ ఎక్స్‌క్లూజన్ క్రోమాటోగ్రఫీ వంటి తక్కువ-అవశేష BDDE ఏకాగ్రత, క్రాస్-లింకింగ్ డిగ్రీ మరియు HA హైడ్రోజెల్స్‌లో ప్రత్యామ్నాయ స్థానాన్ని గుర్తించడానికి అనేక పద్ధతులు ఉన్నాయి. డయోడ్ అర్రే కపుల్డ్ హై పెర్ఫార్మెన్స్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (HPLC).13-17 ఈ అధ్యయనం ఆల్కలీన్ పరిస్థితులలో BDDE మరియు HA ప్రతిచర్య ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన చివరి క్రాస్-లింక్డ్ HA హైడ్రోజెల్‌లో ఉప-ఉత్పత్తిని గుర్తించడం మరియు వర్గీకరించడాన్ని వివరిస్తుంది.HPLC మరియు లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ-మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (LC-MS విశ్లేషణ).BDDE యొక్క ఈ ఉప-ఉత్పత్తి యొక్క విషపూరితం తెలియనందున, దాని అవశేషాల పరిమాణాన్ని తుది ఉత్పత్తిలో సాధారణంగా BDDEలో ప్రదర్శించే పద్ధతికి సమానమైన పద్ధతిలో నిర్ణయించాలని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము.
HA (షిసిడో కో., లిమిటెడ్, టోక్యో, జపాన్) యొక్క పొందిన సోడియం ఉప్పు ~1,368,000 Da (లారెంట్ పద్ధతి) 18 యొక్క పరమాణు బరువు మరియు 2.20 m3/kg యొక్క అంతర్గత చిక్కదనాన్ని కలిగి ఉంది.క్రాస్‌లింకింగ్ రియాక్షన్ కోసం, BDDE (≥95%) సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్ కో. (సెయింట్ లూయిస్, MO, USA) నుండి కొనుగోలు చేయబడింది.సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్ కంపెనీ నుండి pH 7.4తో ఫాస్ఫేట్ బఫర్డ్ సెలైన్ కొనుగోలు చేయబడింది.LC-MS విశ్లేషణలో ఉపయోగించిన అన్ని ద్రావకాలు, అసిటోనిట్రైల్ మరియు నీరు HPLC గ్రేడ్ నాణ్యత నుండి కొనుగోలు చేయబడ్డాయి.ఫార్మిక్ యాసిడ్ (98%) రియాజెంట్ గ్రేడ్‌గా కొనుగోలు చేయబడింది.
అన్ని ప్రయోగాలు UPLC అక్విటీ సిస్టమ్ (వాటర్స్, మిల్‌ఫోర్డ్, MA, USA)పై నిర్వహించబడ్డాయి మరియు ఎలక్ట్రోస్ప్రే అయనీకరణ మూలం (AB SCIEX, ఫ్రేమింగ్‌హామ్, MA, USA)తో కూడిన API 3000 ట్రిపుల్ క్వాడ్రూపోల్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌కు కనెక్ట్ చేయబడ్డాయి.
1% క్షార (సోడియం హైడ్రాక్సైడ్, NaOH) సమక్షంలో 10% (w/w) సోడియం హైలురోనేట్ (NaHA) ద్రావణానికి 198 mg BDDEని జోడించడం ద్వారా క్రాస్-లింక్డ్ HA హైడ్రోజెల్‌ల సంశ్లేషణ ప్రారంభించబడింది.ప్రతిచర్య మిశ్రమంలో చివరి BDDE సాంద్రత 9.9 mg/mL (0.049 mM).అప్పుడు, ప్రతిచర్య మిశ్రమం పూర్తిగా మిశ్రమంగా మరియు సజాతీయంగా మరియు 4 గంటల పాటు 45 ° C వద్ద కొనసాగడానికి అనుమతించబడింది.19 ప్రతిచర్య యొక్క pH ~12 వద్ద నిర్వహించబడుతుంది.
ఆ తర్వాత, ప్రతిచర్య మిశ్రమాన్ని నీటితో కడుగుతారు, మరియు చివరి HA-BDDE హైడ్రోజెల్‌ను 10 నుండి 25 mg/mL వరకు HA గాఢత మరియు 7.4 చివరి pH సాధించడానికి PBS బఫర్‌తో ఫిల్టర్ చేసి పలుచన చేయబడింది.ఉత్పత్తి చేయబడిన క్రాస్-లింక్డ్ HA హైడ్రోజెల్‌లను క్రిమిరహితం చేయడానికి, ఈ హైడ్రోజెల్స్ అన్నీ ఆటోక్లేవ్ చేయబడతాయి (20 నిమిషాలకు 120°C).శుద్ధి చేయబడిన BDDE-HA హైడ్రోజెల్ విశ్లేషణ వరకు 4 ° C వద్ద నిల్వ చేయబడుతుంది.
క్రాస్-లింక్డ్ HA ఉత్పత్తిలో ఉన్న BDDEని విశ్లేషించడానికి, 240 mg నమూనాను తూకం వేసి, మధ్య రంధ్రంలోకి ప్రవేశపెట్టారు (మైక్రోకాన్®; మెర్క్ మిల్లిపోర్, బిల్లెరికా, MA, USA; వాల్యూమ్ 0.5 mL) మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 10,000 rpm వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది. 10 నిమిషాలు.మొత్తం 20 µL పుల్-డౌన్ లిక్విడ్ సేకరించి విశ్లేషించబడింది.
ఆల్కలీన్ పరిస్థితులలో (1%, 0.1% మరియు 0.01% NaOH) BDDE ప్రమాణాన్ని (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్ కో) విశ్లేషించడానికి, కింది షరతులు నెరవేరినట్లయితే, ద్రవ నమూనా 1:10, 1:100 లేదా గరిష్టంగా ఉంటుంది 1:1,000,000 అవసరమైతే, విశ్లేషణ కోసం MilliQ డీయోనైజ్డ్ నీటిని ఉపయోగించండి.
క్రాస్-లింకింగ్ రియాక్షన్‌లో (HA 2%, H2O, 1% NaOH, మరియు 0.049 mM BDDE) ఉపయోగించిన ప్రారంభ పదార్థాల కోసం, ఈ పదార్థాల నుండి తయారు చేయబడిన ప్రతి నమూనాలో 1 mL అదే విశ్లేషణ పరిస్థితులను ఉపయోగించి విశ్లేషించబడింది.
అయాన్ మ్యాప్‌లో కనిపించే శిఖరాల విశిష్టతను గుర్తించడానికి, 10 µL 100 ppb BDDE స్టాండర్డ్ సొల్యూషన్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్ కో) 20 µL నమూనాకు జోడించబడింది.ఈ సందర్భంలో, ప్రతి నమూనాలో ప్రమాణం యొక్క చివరి సాంద్రత 37 ppb.
ముందుగా, 10 μL ప్రామాణిక BDDE (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్ కో)ని 990 μL MilliQ నీటితో (సాంద్రత 1.1 g/mL) పలుచన చేయడం ద్వారా 11,000 mg/L (11,000 ppm) సాంద్రతతో BDDE స్టాక్ సొల్యూషన్‌ను సిద్ధం చేయండి.110 µg/L (110 ppb) BDDE ద్రావణాన్ని ఇంటర్మీడియట్ స్టాండర్డ్ డైల్యూషన్‌గా సిద్ధం చేయడానికి ఈ పరిష్కారాన్ని ఉపయోగించండి.అప్పుడు, 75, 50, 25, 10 మరియు 1 ppb యొక్క కావలసిన ఏకాగ్రతను సాధించడానికి ఇంటర్మీడియట్ డైల్యూంట్‌ను అనేకసార్లు పలుచన చేయడం ద్వారా ప్రామాణిక వక్రతను సిద్ధం చేయడానికి ఇంటర్మీడియట్ BDDE స్టాండర్డ్ డైల్యూయెంట్ (110 ppb)ని ఉపయోగించండి.మూర్తి 1లో చూపినట్లుగా, 1.1 నుండి 110 ppb వరకు ఉన్న BDDE ప్రామాణిక వక్రత మంచి సరళతను కలిగి ఉన్నట్లు కనుగొనబడింది (R2>0.99).నాలుగు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో ప్రామాణిక వక్రత పునరావృతమైంది.
మూర్తి 1 LC-MS విశ్లేషణ ద్వారా పొందిన BDDE ప్రామాణిక అమరిక వక్రరేఖ, దీనిలో మంచి సహసంబంధం గమనించబడింది (R2>0.99).
సంక్షిప్తాలు: BDDE, 1,4-బ్యూటానియోల్ డిగ్లిసిడైల్ ఈథర్;LC-MS, లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ.
క్రాస్-లింక్డ్ HAలో ఉన్న BDDE ప్రమాణాలను మరియు బేస్ సొల్యూషన్‌లో BDDE ప్రమాణాలను గుర్తించడానికి మరియు లెక్కించడానికి, LC-MS విశ్లేషణ ఉపయోగించబడింది.
క్రోమాటోగ్రాఫిక్ విభజన LUNA 2.5 µm C18(2)-HST కాలమ్ (50×2.0 mm2; ఫినోమెనెక్స్, టోరెన్స్, CA, USA)పై సాధించబడింది మరియు విశ్లేషణ సమయంలో గది ఉష్ణోగ్రత (25°C) వద్ద ఉంచబడింది.మొబైల్ దశలో అసిటోనిట్రైల్ (ద్రావకం A) మరియు 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లం కలిగిన నీరు (ద్రావకం B) ఉంటాయి.మొబైల్ దశ గ్రేడియంట్ ఎలుషన్ ద్వారా తొలగించబడుతుంది.ప్రవణత క్రింది విధంగా ఉంది: 0 నిమిషాలు, 2% A;1 నిమిషం, 2% A;6 నిమిషాలు, 98% A;7 నిమిషాలు, 98% A;7.1 నిమిషాలు, 2% A;10 నిమిషాలు, 2% A. రన్నింగ్ టైమ్ 10 నిమిషాలు మరియు ఇంజెక్షన్ వాల్యూమ్ 20 µL.BDDE నిలుపుదల సమయం దాదాపు 3.48 నిమిషాలు (ప్రయోగాల ఆధారంగా 3.43 నుండి 4.14 నిమిషాల వరకు ఉంటుంది).LC-MS విశ్లేషణ కోసం మొబైల్ దశ 0.25 mL/min ప్రవాహం రేటుతో పంప్ చేయబడింది.
MS ద్వారా BDDE విశ్లేషణ మరియు పరిమాణీకరణ కోసం, UPLC సిస్టమ్ (వాటర్స్) API 3000 ట్రిపుల్ క్వాడ్రూపోల్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (AB SCIEX)తో కలిపి ఎలక్ట్రోస్ప్రే అయనీకరణ మూలాన్ని కలిగి ఉంటుంది మరియు విశ్లేషణ సానుకూల అయాన్ మోడ్‌లో (ESI+) నిర్వహించబడుతుంది.
BDDEలో ప్రదర్శించిన అయాన్ ఫ్రాగ్మెంట్ విశ్లేషణ ప్రకారం, అత్యధిక తీవ్రత కలిగిన శకలం 129.1 డా (మూర్తి 6)కి సంబంధించిన శకలంగా నిర్ణయించబడింది.కాబట్టి, క్వాంటిఫికేషన్ కోసం మల్టీ-అయాన్ మానిటరింగ్ మోడ్ (MIM)లో, BDDE యొక్క మాస్ కన్వర్షన్ (మాస్-టు-ఛార్జ్ రేషియో [m/z]) 203.3/129.1 డా.ఇది LC-MS విశ్లేషణ కోసం పూర్తి స్కాన్ (FS) మోడ్ మరియు ఉత్పత్తి అయాన్ స్కాన్ (PIS) మోడ్‌ను కూడా ఉపయోగిస్తుంది.
పద్ధతి యొక్క విశిష్టతను ధృవీకరించడానికి, ఒక ఖాళీ నమూనా (ప్రారంభ మొబైల్ దశ) విశ్లేషించబడింది.203.3/129.1 డా మాస్ కన్వర్షన్‌తో ఖాళీ నమూనాలో సిగ్నల్ కనుగొనబడలేదు.ప్రయోగం యొక్క పునరావృతతకు సంబంధించి, 55 ppb (క్యాలిబ్రేషన్ కర్వ్ మధ్యలో) యొక్క 10 ప్రామాణిక ఇంజెక్షన్‌లు విశ్లేషించబడ్డాయి, ఫలితంగా అవశేష ప్రామాణిక విచలనం (RSD) <5% (డేటా చూపబడలేదు).
నాలుగు స్వతంత్ర ప్రయోగాలకు అనుగుణంగా ఎనిమిది వేర్వేరు ఆటోక్లేవ్డ్ BDDE క్రాస్-లింక్డ్ HA హైడ్రోజెల్స్‌లో అవశేష BDDE కంటెంట్ లెక్కించబడింది."మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్" విభాగంలో వివరించినట్లుగా, పరిమాణీకరణ BDDE స్టాండర్డ్ డైల్యూషన్ యొక్క రిగ్రెషన్ కర్వ్ యొక్క సగటు విలువ ద్వారా అంచనా వేయబడుతుంది, ఇది BDDE మాస్ ట్రాన్సిషన్ 203.3/129.1 Da, నిలుపుదలతో గుర్తించబడిన ప్రత్యేక శిఖరానికి అనుగుణంగా ఉంటుంది. 3.43 నుండి 4.14 నిమిషాల సమయం వేచి ఉండదు.మూర్తి 2 10 ppb BDDE సూచన ప్రమాణం యొక్క ఉదాహరణ క్రోమాటోగ్రామ్‌ను చూపుతుంది.ఎనిమిది వేర్వేరు హైడ్రోజెల్‌ల యొక్క అవశేష BDDE కంటెంట్‌ను టేబుల్ 1 సంగ్రహిస్తుంది.విలువ పరిధి 1 నుండి 2.46 ppb.కాబట్టి, నమూనాలోని అవశేష BDDE ఏకాగ్రత మానవ వినియోగానికి ఆమోదయోగ్యమైనది (<2 ppm).
మూర్తి 2 203.30/129.10 Da (పాజిటివ్ MRM మోడ్‌లో) యొక్క LC-MS విశ్లేషణ ద్వారా పొందిన 10 ppb BDDE రిఫరెన్స్ స్టాండర్డ్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్ కో), MS (m/z) పరివర్తన యొక్క అయాన్ క్రోమాటోగ్రామ్.
సంక్షిప్తాలు: BDDE, 1,4-బ్యూటానియోల్ డిగ్లిసిడైల్ ఈథర్;LC-MS, లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ;MRM, బహుళ ప్రతిచర్య పర్యవేక్షణ;MS, ద్రవ్యరాశి;m/z, మాస్-టు-ఛార్జ్ నిష్పత్తి.
గమనిక: 1-8 నమూనాలు ఆటోక్లేవ్డ్ BDDE క్రాస్-లింక్డ్ HA హైడ్రోజెల్స్.హైడ్రోజెల్‌లో BDDE యొక్క అవశేష మొత్తం మరియు BDDE నిలుపుదల సమయం యొక్క గరిష్ట స్థాయి కూడా నివేదించబడింది.చివరగా, వివిధ నిలుపుదల సమయాలతో కొత్త శిఖరాల ఉనికి కూడా నివేదించబడింది.
సంక్షిప్తాలు: BDDE, 1,4-బ్యూటానియోల్ డిగ్లిసిడైల్ ఈథర్;HA, హైలురోనిక్ యాసిడ్;MRM, బహుళ ప్రతిచర్య పర్యవేక్షణ;tR, నిలుపుదల సమయం;LC-MS, లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ;RRT, సాపేక్ష నిలుపుదల సమయం.
ఆశ్చర్యకరంగా, LC-MS అయాన్ క్రోమాటోగ్రామ్ యొక్క విశ్లేషణ విశ్లేషించిన అన్ని ఆటోక్లేవ్డ్ క్రాస్-లింక్డ్ HA హైడ్రోజెల్ శాంపిల్స్ ఆధారంగా, 2.73 నుండి 3.29 నిమిషాల తక్కువ నిలుపుదల సమయంలో అదనపు గరిష్ట స్థాయి ఉందని తేలింది.ఉదాహరణకు, మూర్తి 3 క్రాస్-లింక్డ్ HA నమూనా యొక్క అయాన్ క్రోమాటోగ్రామ్‌ను చూపుతుంది, ఇక్కడ ఒక అదనపు శిఖరం దాదాపు 2.71 నిమిషాల వేరొక నిలుపుదల సమయంలో కనిపిస్తుంది.కొత్తగా గమనించిన శిఖరం మరియు BDDE నుండి శిఖరం మధ్య గమనించిన సాపేక్ష నిలుపుదల సమయం (RRT) 0.79 (టేబుల్ 1) గా కనుగొనబడింది.LC-MS విశ్లేషణలో ఉపయోగించిన C18 కాలమ్‌లో కొత్తగా గమనించిన శిఖరం తక్కువగా ఉంచబడిందని మాకు తెలుసు కాబట్టి, కొత్త శిఖరం BDDE కంటే ఎక్కువ ధ్రువ సమ్మేళనానికి అనుగుణంగా ఉండవచ్చు.
Figure 3 LC-MS ద్వారా పొందిన క్రాస్-లింక్డ్ HA హైడ్రోజెల్ నమూనా యొక్క అయాన్ క్రోమాటోగ్రామ్ (MRM మాస్ కన్వర్షన్ 203.3/129.0 డా).
సంక్షిప్తాలు: HA, హైలురోనిక్ యాసిడ్;LC-MS, లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ;MRM, బహుళ ప్రతిచర్య పర్యవేక్షణ;RRT, సాపేక్ష నిలుపుదల సమయం;tR, నిలుపుదల సమయం.
గమనించిన కొత్త శిఖరాలు వాస్తవానికి ఉపయోగించిన ముడి పదార్థాలలో ఉండే కలుషితాలు కావచ్చు అనే అవకాశాన్ని తోసిపుచ్చడానికి, ఈ ముడి పదార్థాలను కూడా అదే LC-MS విశ్లేషణ పద్ధతిని ఉపయోగించి విశ్లేషించారు.విశ్లేషించబడిన ప్రారంభ పదార్థాలలో నీరు, నీటిలో 2% NaHA, నీటిలో 1% NaOH మరియు క్రాస్-లింకింగ్ రియాక్షన్‌లో ఉపయోగించే అదే ఏకాగ్రతతో BDDE ఉన్నాయి.ఉపయోగించిన ప్రారంభ పదార్థం యొక్క అయాన్ క్రోమాటోగ్రామ్ ఏ సమ్మేళనం లేదా శిఖరాన్ని చూపలేదు మరియు దాని నిలుపుదల సమయం గమనించిన కొత్త శిఖరానికి అనుగుణంగా ఉంటుంది.ఈ వాస్తవం విశ్లేషణ ప్రక్రియలో జోక్యం చేసుకునే ఏవైనా సమ్మేళనాలు లేదా పదార్ధాలను కలిగి ఉండవచ్చనే ఆలోచనను విస్మరిస్తుంది, కానీ ఇతర ప్రయోగశాల ఉత్పత్తులతో సాధ్యమయ్యే క్రాస్-కాలుష్యం యొక్క సంకేతం లేదు.BDDE మరియు కొత్త శిఖరాల యొక్క LC-MS విశ్లేషణ తర్వాత పొందిన ఏకాగ్రత విలువలు టేబుల్ 2 (నమూనాలు 1-4) మరియు మూర్తి 4లోని అయాన్ క్రోమాటోగ్రామ్‌లో చూపబడ్డాయి.
గమనిక: నమూనాలు 1-4 ఆటోక్లేవ్డ్ BDDE క్రాస్-లింక్డ్ HA హైడ్రోజెల్‌లను ఉత్పత్తి చేయడానికి ఉపయోగించే ముడి పదార్థాలకు అనుగుణంగా ఉంటాయి.ఈ నమూనాలు ఆటోక్లేవ్ చేయబడలేదు.
సంక్షిప్తాలు: BDDE, 1,4-బ్యూటానియోల్ డిగ్లిసిడైల్ ఈథర్;HA, హైలురోనిక్ యాసిడ్;LC-MS, లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ;MRM, బహుళ ప్రతిచర్య పర్యవేక్షణ.
HA మరియు BDDE యొక్క క్రాస్-లింకింగ్ రియాక్షన్‌లో ఉపయోగించిన ముడి పదార్థం యొక్క నమూనా యొక్క LC-MS క్రోమాటోగ్రామ్‌కు మూర్తి 4 అనుగుణంగా ఉంటుంది.
గమనిక: ఇవన్నీ క్రాస్-లింకింగ్ రియాక్షన్‌ని నిర్వహించడానికి ఉపయోగించే అదే ఏకాగ్రత మరియు నిష్పత్తిలో కొలుస్తారు.క్రోమాటోగ్రామ్ ద్వారా విశ్లేషించబడిన ముడి పదార్థాల సంఖ్యలు దీనికి అనుగుణంగా ఉంటాయి: (1) నీరు, (2) 2% HA సజల ​​ద్రావణం, (3) 1% NaOH సజల ద్రావణం.LC-MS విశ్లేషణ 203.30/129.10 Da (పాజిటివ్ MRM మోడ్‌లో) యొక్క మాస్ కన్వర్షన్ కోసం నిర్వహించబడుతుంది.
సంక్షిప్తాలు: BDDE, 1,4-బ్యూటానియోల్ డిగ్లిసిడైల్ ఈథర్;HA, హైలురోనిక్ యాసిడ్;LC-MS, లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ;MRM, బహుళ ప్రతిచర్య పర్యవేక్షణ.
కొత్త శిఖరాల ఏర్పాటుకు దారితీసిన పరిస్థితులను అధ్యయనం చేశారు.క్రాస్-లింక్డ్ HA హైడ్రోజెల్‌ను ఉత్పత్తి చేయడానికి ఉపయోగించే ప్రతిచర్య పరిస్థితులు BDDE క్రాస్-లింకింగ్ ఏజెంట్ యొక్క రియాక్టివిటీని ఎలా ప్రభావితం చేస్తాయో అధ్యయనం చేయడానికి, కొత్త శిఖరాలు (సాధ్యమైన ఉప-ఉత్పత్తులు) ఏర్పడటానికి దారితీస్తుంది, వివిధ కొలతలు నిర్వహించబడ్డాయి.ఈ నిర్ణయాలలో, మేము చివరి BDDE క్రాస్‌లింకర్‌ను అధ్యయనం చేసాము మరియు విశ్లేషించాము, ఇది సజల మాధ్యమంలో NaOH (0%, 1%, 0.1% మరియు 0.01%) యొక్క వివిధ సాంద్రతలతో చికిత్స చేయబడింది, తర్వాత లేదా ఆటోక్లేవింగ్ లేకుండా.అదే పరిస్థితులను అనుకరించే బ్యాక్టీరియా విధానం క్రాస్-లింక్డ్ HA హైడ్రోజెల్‌ను ఉత్పత్తి చేయడానికి ఉపయోగించే పద్ధతి వలె ఉంటుంది."మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్" విభాగంలో వివరించినట్లుగా, నమూనా యొక్క మాస్ ట్రాన్సిషన్ LC-MS ద్వారా 203.30/129.10 డాకు విశ్లేషించబడింది.BDDE మరియు కొత్త శిఖరం యొక్క ఏకాగ్రత గణించబడతాయి మరియు ఫలితాలు టేబుల్ 3లో చూపబడ్డాయి. ద్రావణంలో NaOH ఉనికితో సంబంధం లేకుండా ఆటోక్లేవ్ చేయని నమూనాలలో కొత్త శిఖరాలు కనుగొనబడలేదు (నమూనాలు 1-4, పట్టిక 3)ఆటోక్లేవ్డ్ నమూనాల కోసం, ద్రావణంలో NaOH సమక్షంలో మాత్రమే కొత్త శిఖరాలు గుర్తించబడతాయి మరియు శిఖరం ఏర్పడటం ద్రావణంలోని NaOH ఏకాగ్రతపై ఆధారపడి ఉంటుంది (నమూనాలు 5-8, టేబుల్ 3) (RRT = 0.79).Figure 5 ఒక అయాన్ క్రోమాటోగ్రామ్ యొక్క ఉదాహరణను చూపుతుంది, NAOH సమక్షంలో లేదా లేకపోవడంతో రెండు ఆటోక్లేవ్డ్ నమూనాలను చూపుతుంది.
సంక్షిప్తాలు: BDDE, 1,4-బ్యూటానియోల్ డిగ్లిసిడైల్ ఈథర్;LC-MS, లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ;MRM, బహుళ ప్రతిచర్య పర్యవేక్షణ.
గమనిక: టాప్ క్రోమాటోగ్రామ్: నమూనా 0.1% NaOH సజల ద్రావణంతో చికిత్స చేయబడింది మరియు ఆటోక్లేవ్ చేయబడింది (20 నిమిషాలకు 120°C).దిగువ క్రోమాటోగ్రామ్: నమూనా NaOHతో చికిత్స చేయబడలేదు, కానీ అదే పరిస్థితుల్లో ఆటోక్లేవ్ చేయబడింది.203.30/129.10 Da (పాజిటివ్ MRM మోడ్‌లో) యొక్క మాస్ కన్వర్షన్ LC-MS ద్వారా విశ్లేషించబడింది.
సంక్షిప్తాలు: BDDE, 1,4-బ్యూటానియోల్ డిగ్లిసిడైల్ ఈథర్;LC-MS, లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ;MRM, బహుళ ప్రతిచర్య పర్యవేక్షణ.
అన్ని ఆటోక్లేవ్డ్ నమూనాలలో, NaOHతో లేదా లేకుండా, BDDE ఏకాగ్రత బాగా తగ్గింది (16.6 రెట్లు వరకు) (నమూనాలు 5-8, టేబుల్ 2).BDDE ఏకాగ్రతలో తగ్గుదల అధిక ఉష్ణోగ్రతల వద్ద, BDDE యొక్క ఎపాక్సైడ్ రింగ్‌ను తెరవడానికి 1,2-డయోల్ సమ్మేళనాన్ని ఏర్పరచడానికి నీరు ఒక బేస్ (న్యూక్లియోఫైల్) వలె పనిచేస్తుంది.ఈ సమ్మేళనం యొక్క మోనోఐసోటోపిక్ నాణ్యత BDDE కంటే భిన్నంగా ఉంటుంది మరియు అందువల్ల ప్రభావితం కాదు.LC-MS 203.30/129.10 Da యొక్క మాస్ షిఫ్ట్‌ని గుర్తించింది.
చివరగా, ఈ ప్రయోగాలు కొత్త శిఖరాల ఉత్పత్తి BDDE, NAOH మరియు ఆటోక్లేవింగ్ ప్రక్రియపై ఆధారపడి ఉంటుందని చూపిస్తుంది, కానీ HAతో ఎటువంటి సంబంధం లేదు.
దాదాపు 2.71 నిమిషాల నిలుపుదల సమయంలో కనుగొనబడిన కొత్త శిఖరం అప్పుడు LC-MS ద్వారా వర్గీకరించబడింది.ఈ ప్రయోజనం కోసం, BDDE (9.9 mg/mL) 1% NaOH సజల ద్రావణంలో పొదిగేది మరియు ఆటోక్లేవ్ చేయబడింది.టేబుల్ 4లో, కొత్త శిఖరం యొక్క లక్షణాలు తెలిసిన BDDE రిఫరెన్స్ పీక్‌తో పోల్చబడ్డాయి (నిలుపుదల సమయం సుమారు 3.47 నిమిషాలు).రెండు శిఖరాల యొక్క అయాన్ ఫ్రాగ్మెంటేషన్ విశ్లేషణ ఆధారంగా, 2.72 నిమిషాల నిలుపుదల సమయం ఉన్న శిఖరం BDDE శిఖరం వలె అదే శకలాలు చూపుతుందని, కానీ విభిన్న తీవ్రతలతో (మూర్తి 6) నిర్ధారించవచ్చు.2.72 నిమిషాల నిలుపుదల సమయం (PIS)కి సంబంధించిన గరిష్ట స్థాయికి, 147 Da ద్రవ్యరాశిలో ఫ్రాగ్మెంటేషన్ తర్వాత మరింత తీవ్రమైన శిఖరం గమనించబడింది.ఈ నిర్ణయంలో ఉపయోగించిన BDDE ఏకాగ్రత (9.9 mg/mL) వద్ద, అతినీలలోహిత వర్ణపటంలోని విభిన్న శోషణ మోడ్‌లు (UV, λ=200 nm) క్రోమాటోగ్రాఫిక్ విభజన తర్వాత కూడా గమనించబడ్డాయి (మూర్తి 7).2.71 నిమిషాల నిలుపుదల సమయం ఉన్న శిఖరం ఇప్పటికీ 200 nm వద్ద కనిపిస్తుంది, అదే పరిస్థితుల్లో BDDE శిఖరం క్రోమాటోగ్రామ్‌లో గమనించబడదు.
సుమారు 2.71 నిమిషాల నిలుపుదల సమయంతో కొత్త శిఖరం మరియు 3.47 నిమిషాల నిలుపుదల సమయంతో BDDE శిఖరం యొక్క టేబుల్ 4 క్యారెక్టరైజేషన్ ఫలితాలు
గమనిక: ఈ ఫలితాలను పొందడానికి, రెండు శిఖరాలపై LC-MS మరియు HPLC విశ్లేషణలు (MRM మరియు PIS) నిర్వహించబడ్డాయి.HPLC విశ్లేషణ కోసం, 200 nm తరంగదైర్ఘ్యంతో UV గుర్తింపు ఉపయోగించబడుతుంది.
సంక్షిప్తాలు: BDDE, 1,4-బ్యూటానియోల్ డిగ్లిసిడైల్ ఈథర్;HPLC, అధిక పనితీరు గల లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ;LC-MS, లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ;MRM, బహుళ ప్రతిచర్య పర్యవేక్షణ;m/z, మాస్-టు-ఛార్జ్ నిష్పత్తి;PIS, ఉత్పత్తి అయాన్ స్కానింగ్;అతినీలలోహిత కాంతి, అతినీలలోహిత కాంతి.
గమనిక: ద్రవ్యరాశి శకలాలు LC-MS విశ్లేషణ (PIS) ద్వారా పొందబడతాయి.టాప్ క్రోమాటోగ్రామ్: BDDE ప్రామాణిక నమూనా శకలాలు మాస్ స్పెక్ట్రం.దిగువ క్రోమాటోగ్రామ్: కనుగొనబడిన కొత్త శిఖరం యొక్క మాస్ స్పెక్ట్రం (BDDE శిఖరంతో అనుబంధించబడిన RRT 0.79).BDDE 1% NaOH ద్రావణంలో ప్రాసెస్ చేయబడింది మరియు ఆటోక్లేవ్ చేయబడింది.
సంక్షిప్తాలు: BDDE, 1,4-బ్యూటానియోల్ డిగ్లిసిడైల్ ఈథర్;LC-MS, లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ;MRM, బహుళ ప్రతిచర్య పర్యవేక్షణ;PIS, ఉత్పత్తి అయాన్ స్కాన్;RRT, సాపేక్ష నిలుపుదల సమయం.
మూర్తి 7 203.30 డా పూర్వగామి అయాన్ యొక్క అయాన్ క్రోమాటోగ్రామ్, మరియు (A) 2.71 నిమిషాల నిలుపుదల సమయంతో కొత్త శిఖరం మరియు (B) 200 nm వద్ద 3.46 నిమిషాల వద్ద BDDE రిఫరెన్స్ స్టాండర్డ్ పీక్ యొక్క UV గుర్తింపు.
ఉత్పత్తి చేయబడిన అన్ని క్రాస్-లింక్డ్ HA హైడ్రోజెల్స్‌లో, LC-MS పరిమాణీకరణ తర్వాత అవశేష BDDE ఏకాగ్రత <2 ppm అని గమనించబడింది, అయితే విశ్లేషణలో కొత్త తెలియని శిఖరం కనిపించింది.ఈ కొత్త శిఖరం BDDE ప్రామాణిక ఉత్పత్తికి సరిపోలడం లేదు.BDDE ప్రామాణిక ఉత్పత్తి కూడా సానుకూల MRM మోడ్‌లో అదే నాణ్యత మార్పిడి (MRM మార్పిడి 203.30/129.10 Da) విశ్లేషణకు గురైంది.సాధారణంగా, హైడ్రోజెల్స్‌లో BDDEని గుర్తించడానికి క్రోమాటోగ్రఫీ వంటి ఇతర విశ్లేషణాత్మక పద్ధతులు పరిమితి పరీక్షలుగా ఉపయోగించబడతాయి, అయితే గరిష్ట గుర్తింపు పరిమితి (LOD) 2 ppm కంటే కొంచెం తక్కువగా ఉంటుంది.మరోవైపు, ఇప్పటివరకు, క్రాస్-లింక్డ్ HA ఉత్పత్తుల చక్కెర యూనిట్ శకలాలు క్రాస్-లింకింగ్ మరియు/లేదా HA యొక్క మార్పు స్థాయిని వర్గీకరించడానికి NMR మరియు MS ఉపయోగించబడ్డాయి.ఈ టెక్నిక్‌ల యొక్క ఉద్దేశ్యం ఈ ఆర్టికల్‌లో మేము వివరించినట్లుగా (మా LC-MS పద్ధతి యొక్క LOD = 10 ppb) తక్కువ సాంద్రతలలో అవశేష BDDE గుర్తింపును లెక్కించడం ఎప్పుడూ జరగలేదు.